A estimativa do número de usuários é baseada em pesquisas independentes já que a empresa não informa oficialmente número de contas ativas. Em novembro de 2008, Jeremiah Owyang estimou que o Twitter possuia entre 4 a 5 milhões de usuários. Já em maio de 2009, outro estudo analisou mais de 11 milhões e meio de contas de usuários. Um estudo da Universidade de Harvard concluiu que apenas 10% dos usuários produzem 90% do conteúdo.
Em Fevereiro de 2009 o blog "Compete.com" elegeu o Twitter em terceiro lugar como rede social mais usada.
Posteriormente, em 14 de Setembro de 2010, o Twitter divulgou em seu próprio site o número total de usuários registrados: 175 milhões.
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